人肠类器官培养及基因导入体系建立

目的 建立体外人肠类器官培养以及基于慢病毒介导的基因高效导入体系.方法 (1)将外科手术中回肠或结肠标本取下3～5cm后,将黏膜层与肌层分离开,用预冷的乙二胺四乙酸螯合液消化、分离并收集肠隐窝.用基质胶重悬肠隐窝后接入预热的96孔板,待凝固后再加入含有生长因子的培养基,每日观察类器官生长情况,每隔2～3d更换培养基,6～7d后传代.(2)包装高滴度带有报告基因-绿色荧光蛋白的慢病毒感染肠类器官,观察类器官中绿色荧光的表达量.结果 分离的肠隐窝可在体外培养形成“出芽”球状的微型肠类器官结构,且两组隐窝-类器官的存活效率均大于70％.在小肠类器官中可以表达正常肠上皮组织中吸收细胞相关的蛋白标志物.使用慢病毒载体导入的报告基因可以在类器官中持续稳定地表达.结论 这种新型的肠类器官培养模型有利于研究基因在肠稳态维持中的功能.