基于原生质体的谷子CRISPR/Cas9基因编辑系统优化

为了优化和筛选谷子中高效的 CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISRP-associated nuclease 9)基因编辑系统,针对谷子八氢番茄红素脱氢酶基因(SiPDS)设计6种gRNA(gRNA1—gRNA2针对外显子1,gRNA3—gRNA6针对外显子12),构建多种CRISPR/Cas9基因编辑系统,通过聚乙二醇(PEG)介导的方法转入谷子原生质体中,然后利用开发的大规模平行测序技术快速检测它们对SiPDS的突变效率.结果表明,采用7 d谷子黄化苗幼茎建立的原生质体转化系统的转化效率较高,为50.44％～57.36％.将Super启动子(SP)、谷子内源的泛素启动子(Ubi)分别驱动Cas9基因的基因编辑系统转入谷子原生质体中,发现两者对SiPDS基因的突变效率分别为0.5％、5.5％.随后采用Ubi启动子驱动Cas9基因,比较单一gRNA、双gRNA和tRNA结构的基因编辑系统对SiPDS基因的突变效率,发现双gRNA基因编辑系统Ubi-dgRNAE1和Ubi-dgRNAE12的突变效率分别较单一gRNA基因编辑系统提高了1.66倍和1.11倍;tRN A基因编辑系统Ubi-tRNA的突变效率较单一gRNA基因编辑系统提高了 5.87倍,为51.24％,且Ubi-tRNA可同时针对多个位点进行编辑,其多位点突变频率为3.23％.比较gRNA3、gRNA4、gRNA5体外转录产物分别与Cas9蛋白混合制成的核糖核蛋白(RNP)复合物的体外切割活性,发现RNP-gRNA5复合物体外切割活性最高,其对SiPDS基因的突变效率是2.0％,并且引起的突变类型主要为小于3 bp的缺失.