利用拆分绿色荧光蛋白检测端粒酶TERT亚基与端粒末端蛋白TPP1的相互作用

目的:构建pCDH-Flag-NGFP-TERT、pCDH-Myc-TPP1-CGFP基因的真核表达载体,验证TPP1-CGFP蛋白能募集到端粒区,并通过GFP蛋白自发重建检测TERT与TPP1的相互作用.方法:以相应质粒为模板,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增出NGFP、CGFP、TPP1的CDS区编码序列.通过酶切、重组将NGFP插入到pCDH-Flag-TERT载体上,将TPP1-CGFP插入到pCDH-Myc-POT1-v5tag载体上.经菌液PCR、载体酶切及测序验证后转染到293T细胞中,采用蛋白质印迹法检测其表达,免疫荧光和端粒Fish验证TPP1-CGFP能募集到端粒区,将TPP1-CGFP与NGFP-TERT共转重新组装成GFP蛋白验证其相互作用.结果:双酶切结果显示载体构建成功;Western blot结果显示蛋白质成功表达;免疫荧光及端粒Fish显示TPP1-CGFP能募集到端粒区,质粒共转能重新组装成GFP蛋白说明两者有相互作用.结论:真核表达载体构建成功,并证明TPP1-CGFP能募集到端粒区,且拆分后的GFP蛋白能由连接蛋白的相互作用而重新组装并发绿色荧光,为研究端粒酶与TPP1蛋白及端粒的相互作用提供了可视化的细胞模型.